Quand meurt sa mère, en 1536, on le fait admettre comme enfant de chœur dans la maîtrise de la basilique Sainte-Marie-Majeure, à Rome. Sous la direction de plusieurs maîtres de chapelle, dont Firmin Lebel, il étudie les maîtres des écoles franco - flamande et italienne : Josquin Des Prés, Jean Mouton, Pierre de La Rue, Antoine Brumel.

En 1544, il est reçu comme organiste de la cathédrale de sa cité natale et épouse en 1547 Lucrezia Gori.

En 1550, l'évêque de Palestrina est élu pape sous le nom de Jules III, il fait venir à Rome en 1551 son ancien organiste et lui confie le poste de maître des enfants de la basilique Saint -  Pierre, puis celui de chanteur de sa chapelle particulière. Palestrina lui dédie son premier livre de messes en 1554.

En 1555, le pape le récompense en le faisant membre de la Chapelle Sixtine, mais en septembre de cette même année, le pape Paul IV succédant à Marcel II, congédie Palestrina en invoquant la règle du célibat. Le 1er octobre 1555, Palestrina devient maître de chapelle de l'église St-Jean - de - Latran, une des églises les plus importantes de Rome, il y demeure jusqu'en 1560.

Le 1er mars 1561, il est nommé à Sainte-Marie-Majeure puis il prend la direction de l'enseignement musical au Seminario Romano fondé par le pape Pie IV en 1563 après la conclusion du Concile de Trente.

Du 1er août 1567 jusqu'en mars 1571, il est au service du cardinal Hippolite d'Este.

En 1571, il est réintégré comme maître de musique à Saint - Pierre de Rome où il exercera sa fonction jusqu'à sa mort.

Devenu veuf en 1580, il songe à entrer dans les ordres mais se remarie l'année suivante avec la veuve d'un riche fourreur de la cour pontificale. Au cours des années suivantes, il se consacre surtout à la gestion de la fortune de sa femme tout en continuant son œuvre de musicien. Ami de Philippe de Néri, apprécié des papes Jules III, Marcel II, Grégoire XIII et Grégoire XIV, reconnu dans toute l'Europe comme le premier compositeur de son temps, Palestrina mourut âgé de 68 ans et fut inhumé à Saint - Pierre, dans la Cappella Nuova.

Avec ses contemporains Byrd et Lassus, Palestrina est l'un des plus grands compositeurs de son temps, il a maîtrisé le style polyphonique de l'école franco - flamande, créant des œuvres d'une beauté et d'une habileté technique inégalées. Sa musique sacrée reste la part la plus glorieuse de son œuvre.

Extrêmement prolifique, il a composé 104 messes, plus de 375 motets, 68 offertoires, 65 hymnes, 35 magnificat, plus de 140 madrigaux, des lamentations, des litanies et des psaumes.